Отчет о результатах изучения эффективности ТF в комплексном лечении больных описторхозом

Отчет о результатах изучения эффективности ТRANSFER FACTOR PLUS в комплексном лечении больных описторхозом

Карбышева Н.В., Султанов Л.В., Белых С.И., Оганова Э., Мак Косланд К. Г. Барнаул, Алтайский медицинский университет, кафедра инфекционных болезней и эпидемиологии, Алтайский центр по профилактике и борьбе со СПИДом, «4-Life Research L.C.», США

ВВЕДЕНИЕ

Описторхоз является одним из самых распространенных и социально значимых гельминтозов в России. Очаги описторхоза имеются в бассейнах рек Обь, Иртыш, Енисей, Волга, Кама, Днепр, Урал, Северная Двина. Регион Западной Сибири признан в числе чрезвычайно напряженных в мире очагов описторхозной инвазии. В среднем течении Оби и низовьях Иртыша пораженность местного населения достигает 70-80% и даже 90%. Анализ общей заболеваемости описторхозом в Алтайском крае выявляет стабильно высокий ее уровень, более чем в 2 раза превышающий показатель по России, достигающий в ряде районов 300,0-400,0 на 100000 населения.Такая распространенность инвазии, продолжительность жизненного цикла паразитов (более 20 лет) в организме хозяина, многообразие вызываемых ими клинических проявлений, серьезность осложнений и исходов (первичный рак печени) определяют чрезвычайную актуальность данной проблемы, необходимость поиска путей ее решения (1, 3, 4, 5, 6, 11). И в первую очередь такой поиск должен быть направлен на повышение результативности лечения больных.

Положение о необходимости коррекции дисбаланса иммуного ответа при описторхозе высказывалось многими исследователями (2, 9, 12). В то же время литературные данные, освещающие состояние гуморального и клеточного звеньев иммунной системы при этой инвазии, чрезвычайно противоречивы (2, 9). Размах колебаний значений иммунологических показателей от достоверно значимых превышений нормативных уровней до достоверного их снижения при идентичных проявлениях процесса. Наиболее согласуются данные о значительной уязвимости при описторхозе Т-системы лимфоцитов, что проявляется изменением количественных характеристик этой популяции и её субпопуляций (9). В связи с этим рекомендации по иммунореабилитации в комплексной терапии описторхоза носят общий характер (10, 12) без определения группы лекарственных средств в большом арсенале препаратов, оказывающих влияние на состояние иммунного ответа (13).

Проведенные нами ранее исследования по изучению гуморального звена иммунной системы у больных описторхозом – определение уровней иммуноглобулинов класса М, G, A (IgM, IgG, IgA) и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови (7) позволили рассматривать выявленную активацию иммунного ответа при хроническом описторхозе как отражение взаимодействия с антигеном, характеризующимся слабовыраженной иммуногенностью. Гуморальные компоненты иммунного ответа при данной инвазии являются скорее её специфическими маркерами, но не обладают защитными свойствами, что приводит к персистенции описторхиев и взаимной адаптации паразита и хозяина на длительный срок. Данное положение легло в основу поиска средства для проведения иммунореабилитации при хронической фазе описторхоза. Установлено, что развитие специфического защитного иммунного ответа, даже при длительной персистенции этиологического фактора, можно обеспечить путем активации первой стадии иммунного ответа с максимальной индукцией цитокинов первой фазы (14). Чрезвычайно важными являются сведения о роли ИНФ-гамма (IFN-γ) в активации антигенпредставляющих клеток — макрофагов. IFN-y стимулирует экспрессию молекул АГ ГКГ 2 класса, необходимых для развития специфического иммунного ответа (16, 17).

В этой связи представило интерес остановить свой выбор на трансфер-факторах, представляющих собой сигнальные молекулы, которые «обучают» и «тренируют» незрелые иммунные клетки или в случае хронических процессов способны научить полноценно распознавать многие микроорганизмы (15). Существующие трансфер-факторы подразделяются на три основные фракции, названные в соответствии с их основным действием на иммунную систему: индукторы, антиген-специфичные трансфер-факторы и супрессоры. Имеются многочисленные сообщения об успешном применении препаратов трансфер-фактора в лечении вирусных, паразитических, грибковых, онкологических, неврологических и аутоиммунных заболеваний (15).

ЦЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценить эффективность применения препарата Transfer Factor Plus при лечении больных хроническим описторхозом.

Задачи исследования:

1. Оценить клиническую эффективность применения препарата Transfer Factor Plus в комплексной терапии хронического описторхоза в сравнении с базовым лечением.
2. Провести оценку функционального состояния гуморального звена иммунной системы у больных хроническим описторхозом и в резидуальном периоде инвазии в зависимости от проводимого лечения.
3. Определить уровни концетраций провоспалительных цитокинов при хронической фазе описторхоза на фоне проводимой терапии.
4. Изучить уровень аутоантител к антигенам нативной и денатурированной ДНК в зависимости от течения описторхоза и проводимого лечения.

ВИД ИССЛЕДОВАНИЯ

Открытый клинический эксперимент с полной информированностью пациентов, обследование и лечение больных в Центре по диагностике и лечению описторхоза и «редких» гельминтозов на база инфекционного отделения городской больницы № 5 г. Барнаула.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Обследовано 94 пациента в возрасте от 20 до 60 лет. У 24 (25,5%) больных инвазия протекала латентно, у 70 (74,5%) – клинически выражено. Преобладали гепатохолангитический (40,9%), астеновегетативный (33,3%) варианты течения хронической фазы течения описторхоза. У 30% больных на коже периодически появлялись высыпания, у 12% возникали приступы удушья по типу бронхиальной астмы, артралгический синдром развился у 25 (27%) больных, явления васкулита — у 17 (18%). В 95% случаев описторхоз был выявлен впервые, у остальных пациентов в анамнезе курс дегельминтизации бильтрицидом, без эффекта. Диагноз хронического описторхоза верифицировали данными микроскопии желчи (дуоденальное зондирование) или содержимого кишечника (наличие яиц Op.felineus или взрослых паразитов).

У всех наблюдаемых больных изучено состояние гуморального звена иммунной системы – в сыворотке крови проведено определение уровня иммуноглобулинов трех основных классов M, G, A, содержания циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК); исследован уровень аутоантител к антигенам нативной и денатурированной ДНК (К нДНК и К дДНК). У 45 больных хроническим описторхозом определена концентрация провоспалительных цитокинов (IL-1b, TNF-a, IFN-y).

Всем больным проведена антигельминтная терапия бильтрицидом (фирма «Байер») по рекомендуемой схеме: 75 мг на кг/массы в три приема, перорально, курс лечения – 1 день. 50 больным этой группы (1-я группа, опыт) после приема антигельминтика проведен 7-ми дневный курс лечения Transfer Factor Plus. Препарат назначался по 2 капсулы 3 раза в сутки. Остальные 44 пациента, получавшие только бильтрицид, составили контрольную группу (2-я группа), сопоставимую по полу, возрасту, клиническим проявлениям обследуемых больных.

Все исследуемые показатели в 2 – х группах больных определяли до начала терапии и через 2 недели, 3 месяца после ее проведения. Диспансерное наблюдение осуществлялось на протяжении полугода.

Для оценки полученных данных обследовано 75 доноров в возрасте от 18 до 50 лет.

Определение ЦИК проведено методом преципитации 4% ПЭГ-6000. Величину оптической плотности определяли против контроля при длине волны 450 нм на вертикальном спектрофотометре Multiskan МСС/340. Количество ЦИК выражали в условных единицах (у.е.).

Опредение концентрации цитокинов в сыворотке крови выполнено на тест-системах ProCon IL-1b, ProCon TNF-a, ProCon IFN-y производства ООО «Протеиновый контур» С.-Петербург по инструкции производителя. Результаты иммуноферментного анализа регистрировали на вертикальном фотометре Multiskan MСС 340 в при длине волны 492 нм. Для определения концентрации интерлейкинов в анализируемых образцах строился калибровочный график по средним оптической плотности каждого стандартного раствора.

Содержание иммуноглобулинов определялось прямым сандвич вариантом иммуноферментного анализа. В работе применяли коммерческий коньюгат пероксидазы с антителами к иммуноглобулинам человека (Московский НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), моноспецифические антисыворотки к иммуноглобулинам человека А, М, G, стандартную сыворотку крови человека производства этого же института или Горьковского НИИЭМ. В качестве твердой фазы использовали 96-луночные планшеты для иммунологических реакций. Детекцию проводили на вертикальном фотометре Multiskan MСС 340 в двух волновом режиме 492/600 нм.. Вычисления проводили с помощью персонального компъютера и прикладной программы, разработанной на базе SK4 для сандвич-варианта ИФА.Так же исследования выполнялись на тест-системах IgM, IgA, IgG-стрип производства ЗАО «Вектор-БЕСТ» по инструкции производителя. Результаты иммуноферментного анализа регистрировали на вертикальном фотометре Multiskan MСС 340 в при длине волны 492 нм.

Аутоантитела к антигенам нативной ДНК в сыворотке крови человека определялись с помощью тест-системы «ДНК-ТЕСТ» производства ПМЦ Сибмедприбор. Результаты иммуноферментного анализа регистрировали на вертикальном фотометре Multiskan MСС 340 при длине волны 492 нм. Результаты теста считались положительными, если оптическая плотность анализируемой сыворотки была больше критической оптической плотности, которая составляла — оптическая плотность отрицательного контроля Х 2. Уровень аутоантител к нативной ДНК определялся в цифровом выражении, которое равнялось — оптическая плотность исследуемого образца, деленная на критическую оптическую плотность.

Статистическая обработка вариационных рядов включала подсчет средних арифметических величин (X) и стандартных ошибок средних арифметических (m), стандартного отклонения. В таблицах и рисунках информация представлена в виде X ? m. В работе использовались методы непараметрической статистики. Значимость различий вариационных рядов в связанных попарно выборках оценивалась с помощью U — критерия Вилконсона — Манна — Уитни, корреляция показателей вычислялась по методу Спирмена. Анализ данных проводился с помощью пакета прикладных программ Statgraf.

ПРЕРЫВАНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ЗАМЕНЫ

Все 50 больных получали Transfer Factor Plus по запланированной схеме. Введения новых лиц не требовалось.

КЛИНИЧЕСКИЕ СОБЫТИЯ И СЛУЧАИ, КОТОРЫЕ ПОТРЕБОВАЛИ НЕМЕДЛЕННОЙ ОГЛАСКИ

Названных событий и случаев в проводимом исследовании не наблюдалось.

ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведенные наблюдения показали хорошую переносимость препарата Transfer Factor Plus. У пациентов 1-ой группы после назначения антигельминтика и приема Transfer Factor Plus при сравнении с контрольной группой не зарегистрировано развития астеновегетативного синдрома и появления или усиления болей в правом подреберье, часто возникающих после приема бильтрицида (у 73% и 52% больных 2-ой группы соответсвенно). Назначение Transfer Factor Plus сыграло существенную роль в клинике резидуального периода описторхоза. В 1-ой группе обследуемых через 4 месяца после лечения у всех больных с артралгическим синдромом (12 человек) и у 7 из 9 больных с васкулитами наступило полное выздоровление. Во 2-ой группе, получавших только бильтрицид, остаточные явления в виде артралгий, васкулитов продолжали беспокоить соответсвенно в 95% и 100% случаев весь регламентируемый при описторхозе период диспансерного наблюдения (в течение полугода).

Результаты исследования состояния гуморального звена иммунной системы у пациентов с хронической фазой описторхоза до лечения показали, что практически в 100% случаев у обследованных больных обнаруживаются те или иные изменения.

В сыворотке крови достоверно увеличено содержание всех трех классов иммуноглобулинов (табл.1). Более чем в 2 раза при оценке «средних» значений уровень иммуноглобулина класса М превышал показатели «средней» контрольной группы (р < 0,001).

Установлено достоверное повышение уровня IgG. Наибольшей выраженности у наблюдаемых больных достигала продукция IgА (р < 0,001).

Хроническая фаза описторхоза характеризовалась и достоверно повышенным образованием ЦИК. При проведении корреляционного анализа была установлена обратная взаимосвязь между уровнем ЦИК и концентрацией IgA (-0,64, p<0,001) при меньшей зависимости образования ЦИК от содержания IgM (-0,26) и IgG (-0,32).

Превышение границы значений контрольной группы отмечено как у больных с манифестным течением описторхоза, так и у 60 % больных с латентным течением инвазии.

Выявленная в целом активация гуморального звена иммунной системы при хронической фазе описторхоза, по-видимому, отражает особенности взаимодействия макроорганизма с антигеном, характеризующимся слабовыраженной иммуногенностью. На наш взгляд, гуморальные компоненты иммунного ответа при описторхозной инвазии являются лишь её специфическими маркерами, но не обладают защитными свойствами, что и обеспечивает длительное выживание Op.felineus в организме хозяина.

Кроме того, данные коррелятивного анализа позволяют предполагать образование ЦИК при хроническом описторхозе преимущественно за счет IgA.

У 45 больных хроническим описторхозом до проведения антигельминтной терапии определяли уровни концентраций IL-1b, TNF-a, IFN-y.

Результаты исследования концентрации основного провоспалительного интерлейкина IL-1b показали достоверное увеличение ее уровня, более чем в пять раз превышающее значения «средней» группы доноров (р < 0,001). Анализ индивидуальных значений полученных данных показал увеличение концентрации IL-1b у всех обследуемых.

Концентрация TNF-a была также повышена, но достоверных различий при сравнении со «средней» в группе доноров установить не удалось.

В то же время исследование уровня концентрации IFN-y у больных хроническим описторхозом не выявило достоверных различий с показателями в группе доноров (p > 0,05).

Существующий дисбаланс содержания исследованных цитокинов может рассматриваться как еще одно свидетельство неполноценности иммунного ответа при хронической фазе описторхоза с отсутствием главной компоненты — защитного эффекта. Мы видим повышение концентрации IL-1b, способного индуцировать большую часть местных и общих проявлений воспалительной реакции, запускающего начальные события иммунного ответа, в частности к вовлечению в него Т-хелперов (14). Способность Op.felineus к “экранированию” как поверхностных структур паразита, так и высокоиммуногенных антигенов (8), по-видимому, объясняет тот факт, что лишь у небольшой части обследованных повышен уровень TNF-a, продукция которого включается в том числе и при условии распознавания липопротеидов экзогенов.

Как отражение индукции слабо специфического иммунного ответа может рассматриваться у больных хроническим описторхозом при сравнении с нормативными значениями отсутствие сдвигов уровня IFN-y, роль которого в активации антигенпредставляющих клеток – макрофагов и последующей стимуляции экспрессии молекул АГ ГКГ 2 класса, необходимых для развития специфического иммунного ответа чрезвычайно важна (16, 17).

При оценке уровня аутоантител к антигенам нативной ДНК в группе больных до лечения (табл. 1) выявлен К нДНК, равный 4,80?0,22, достоверно превышающий »среднюю» группы »практически здоровых» лиц.

В процессе обследования больных описторхозом высокий уровень аутоантител выявлен и к антигенам денатурированной ДНК (табл. 1). Мы видим тот же характер процесса – достоверное повышение К дДНК до лечения при сравнении с группой »практически здоровых» лиц (p<0,001).

Анализ существующих индивидуальных разбросов показателей К нДНК и К дДНК в группах обследуемых больных при сравнении с группой »практически здоровых» лиц показал высокий уровень аутоантител более чем в 90 % случаев.

Выявленная динамика уровня антител к антигенам нативной и денатурированной ДНК не зависела от течения описторхоза – латентного или манифестного (p > 0,05).

Корреляционный анализ показал обратную взаимосвязь между содержанием ЦИК и уровнем антител к антигенам денатурированной ДНК (-0,73, p<0,001).

Таким образом, высокий уровень аутоантител к антигенам нативной и денатурированной ДНК у больных описторхозом независимо от течения инвазии – латентного или манифестного, свидетельствует о выраженности деструктивных процессов как аутоиммунного характера, так и с возможным участием иммунных комплексов.

Использование традиционной только антигельминтной терапии бильтрицидом не сопровождалось существенными изменениями изучаемых показателей состояния гуморального звена иммунной системы, отражая определенную монотонность процесса.

На протяжении всего периода наблюдений практически без изменений при сопоставлении с показателями до лечения оставались уровни IgG и ЦИК. Через 2 недели после лечения бильтрицидом несколько выше стал уровень IgM, что можно рассматривать как результат дейстивия антигельминтика, «обнажающего» высокоиммунногенные структуры паразита (3,8). Отмечено некоторое повышение уровня IgA.

Деструктивные процессы, напротив, по данным уровня аутоантител к антигенам нативной и денатурированной ДНК к 3 месяцам наблюдения достигли своей максимальной выраженности.
В группе больных, получавших наряду с антигельминтиком Transfer Factor Plus, выявлена иная динамика изучаемых иммунобиохимических  показателей.

Уже через  2 недели после лечения отмечено нарастание уровня IgG и более активное образование ЦИК. Максимальных значений уровень ЦИК в этой группе достигал через 3 месяца после лечения, в 2,5 раза превышая показатели во 2 группе.

Концентрации провоспалительных IL-1? и TNF-? существенно не изменились (табл. 2), оставаясь повышенными при сравнении с донорами (p < 0,05), достоверно не отличаясь от значений контрольной группы. Значительно возросло при применении Transfer Factor Plus содержание IFN-y, более чем в 2 раза с показателями до лечения и в контрольной группе.

Весьма существенным является меньшая выраженность деструктивных процессов у пациентов 1-ой группы. К 3-ему месяцу уровни аутоантител к антигенам нативной и денатурированной ДНК значительно снижались  (p < 0,001 при сравнении со 2-ой группой).

ВЫВОДЫ

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о несомненной клинико-иммунологической эффективности Transfer Factor Plus. Применение данного продукта способствует активации моноцитарно-макрофагального звена, что определяется увеличением концентрации IL-1b и TNF-c и особенно IFN-y, приводящей к индукции второй фазы иммунного ответа, с последующим формированием специфического защитного иммунитета. Иммунореабилитация с использованием Transfer Factor Plus, проводимая вслед за дегельминтизацией бильтрицидом способствует скорейшей элиминации антигенов описторхиев (динамичное образование ЦИК), предупреждая тем самым развитие иммунопатологических процессов, деструкции при хроническом описторхозе и обеспечивает более полное и раннее выздоровление. Применение Transfer Factor Plus считаем целесообразным в комплексном лечении больных данной инвазией.

Список литературы

• Альперович Б.И. Хирургия осложнений описторхоза / Бражникова Н.А., Ли А.Б. – Томск: Томский университет, 1990. – 224 с.
• Белозеров Е.С. Описторхоз / Шувалова Е.П. – Л.: Медицина, 1981. – 128 с.
• Богоявленский Ю.К. Сравнительные микроморфологические исследования тканей описторхисов и печени хозяина после применения различных антигельминтиков // Описторхоз. Современное состояние проблемы, перспективы развития: Сб. тез. Юбилейной конф. – Тюмень, 1991. – С. 17-19.
• Бронштейн А.М. Лечение празиквантелем печеночных и кишечных трематодозов и кишечных цестодозов / Лучшев В.И. // Эпидемиология и инф. болезни. –1997. — № 3. – С. 59-61.
• Ильинских Е.Н. Экогенетика описторхоза и персистенция вируса Эпштейна-Барр / Новицкий В.В., Лепехин А.В., Ильинских Н.Н., Логвинов С.В., Ильинских И.Н. – Новосибирск: «Крокус», 2000. –267с.
• Карапетян М.С. К вопросу о роли продуктов метаболизма описторхисов в патогенезе рака ободочной кишки // Описторхоз. Современное состояние проблемы, перспективы развития: Сб. тез. Юбилейной конф. – Тюмень, 1991. – С. 86-88.
• Карбышева Н.В. Иммунный ответ у больных хроническим описторхозом /Трунов А.Н., Киушкина И.Н., Обухова О.О./ Консилиум. -2001. -№ 6. С. 15-18.
• Котелкин А.Т. Поиски изучения иммунологических маркеров Opisthorchis felineus и исследование возможности их использования для иммунодиагностики описторхоза: Автореф. дис. … канд. биологических наук. -–Кольцово, 2000. – 20 с.
• Лепехин А.В. Эпидемиология, клиника и профилактика описторхоза / Мефодьев В.В., Филатов В.Г., Бужак Н.С. – Томск, 1992. – 230 с.
• Налобин В.А. Закономерности восстановительного процесса после химиотерапии описторхоза // Описторхоз. Современное состояние проблемы, перспективы развития: Сб. тез. Юбилейной конф. – Тюмень, 1991. – С. 163-165.
• Сергиев В.П. Паразитарные болезни человека, их профилактика и лечение / Лебедева М.Н., Фролова А.А., Романенко Н.А.// Эпидемиология и инф. болезни. –1997. — № 2. – С. 8 — 10.
• Степанова Т.Ф. Клиническая реабилитация в комплексе мер борьбы с описторхозом / Скареднов Н.И. // Описторхоз. Современное состояние проблемы, перспективы развития: Сб. тез. Юбилейной конф. – Тюмень, 1991. – С. 232 – 234
• Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Основные принципы иммуномодулирующей терапии // Аллергия, астма и клиническая иммунология. — 2000. — N1. — C.9-16.
• Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Современные представления о защите организма от инфекций // Иммунология. — 2000. — N1. — C.61-64.
• Хэннен Д. Трансфер Фактор – Плюс /Под ред. Ю.П.Гичева и Э.Огановой. – Новосибирск, 2001. – 73 с.
• Paul W.E., Seder R.A. Lymphocyte responses and cytokines // Cell. — 1998. — V.76. — P.241.
• Roirr I., Brostoff J., Male D. Immunology. — Fourth Edition. — 1998. — 281 p.

Таблица 1

Изменение иммунобиохимических показателей у больных хроническим описторхозом в зависимости от вида лечения ()

Примечание: 1-я группа, лечение с применением Transfer Factor Plus;
2 –я группа, лечение без применения Transfer Factor Plus;
p  – достоверные различия с донорами;
р1 — достоверные различия до и после лечения;
р2 —  достоверные различия после лечения между группами.

Таблица 2

Изменение концентрации цитокинов у больных хроническим описторхозом в зависимости от вида лечения ()

Примечание: 1-я группа, лечение с применением Transfer Factor Plus;
2 –я группа, лечение без применения Transfer Factor Plus;
p  – достоверные различия с донорами;
р1 — достоверные различия до и после лечения;
р2 —  достоверные различия после лечения между группами.